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染料DiI,DiO,DiD和DiR是一类亲脂性荧光染料家族，用于标记细胞膜和疏水性组织。这是一类环境敏感型荧光染料，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子(例如蛋白质，虽然在水中其荧光强度很弱)结合时，其荧光强度显著增强。它们具有很高的淬灭系数，偏光依赖性和很短的激发寿命。一旦应用于细胞中，这种染料会在细胞内质膜中逐步扩散，导致在其最佳浓度条件下，将整个细胞染色。

它们不同的荧光颜色：DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)，为活细胞多色彩荧光成像分析和流式细胞术提供了一种便捷的工具。DiO和DiI可以分别与标准的FITC和TRITC滤光器一同使用，其中，DiO可以被633nm He-Ne激光激发，并且具有比DiI更长的激发和发射光波长，为标记细胞和组织的那些本身就具有本底荧光的染料提供了非常卓越的替代品。

DiR在活体成像或者示踪中非常有用，因为它们所发射的红外光可以高效地穿过细胞和组织，并且在红外光范围内，其本底荧光水平很低。

• DiD，DiO，DiI，DiR细胞膜染色液制备
  
  • 配置DMSO或EtOH储存液：储存液用DMSO或EtOH配置浓度1～5mM。
    注意：未使用的储存液保存在-20℃，避免反复冻融。
    
  • 工作液制备：用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1～5μM的工作液。
    注意：工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。
• 悬浮细胞染色
  
  • 悬浮细胞密度为1×10⁶/mL加入到工作液中。
    
  • 在37℃培养细胞2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
    
  • 染色细胞试管在1000～1500转离心5分钟。
    
  • 倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液。
    
  • 重复c,d步骤两次以上。
• 粘壁细胞的染色
  
  • 使粘壁的细胞在无菌实验室培养。
    
  • 从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
    
  • 在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
    
  • 在37℃培养细胞2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
    
  • 吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。
• 流式细胞仪的检测
  DiO、DiI、DiD、DiR染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。